Микробиология: методы Правила работы в микробиологической лаборатории Приготовление прапаратов для микроскопии Исследование окрашенных препаратов Кровь: микробиологическое исследование Микроскопия вирусов Питательные среды Стерилизация лабораторного оборудования Среды для дрожжей и грибов
Стерилизация лабораторного оборудования
Стерилизация (от латинского слова sterilis — бесплодный) — обеспложивание, освобождение от всего живого. В микробиологической практике стерилизации подвергают инструменты, посуду, питательные среды и другие материалы, применяемые в работе.
Стерильность может быть достигнута при помощи физических и химических методов.
Стерилизация, в отличие от дезинфекции, предусматривает уничтожение в стерилизуемом объекте всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными способами: паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта.
Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования
Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.
Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1—10 штук. Пастеровские пипетки по 3—15 шт. заворачивают в оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.
В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2—2,5 см и длиной 50—70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерилизуют в них.
Лабораторную посуду стерилизуют:
а) сухим жаром при температуре 180°С и 160°С соответственно 1 ч и 150 минут.
б) в автоклаве при давлении 1,5 атм. в течение 60 минут, для уничтожения споровой микрофлоры – 90 минут при 2 атм.
Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобранном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2% растворе гидрокарбоната натрия 30 минут. При работе со спороносной микро¬флорой стерилизацию производят в автоклаве при 132±2°С (2 атм.) в течение 20 мин, при 126±2°С (1,5 атм.) — 30 мин. Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, пред¬варительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.
Стерилизация металлических инструментов. Металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) стерилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомендуется обертывать ватой.
Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования.
Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Прокаливание в целом занимает 5—7 с.
Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут.
Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нужной величины. После этого каждый вид материала в отдельности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.
Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Изделия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в течение 30 минут; при загрязнении спороносной микрофлорой—в автоклаве при давлении 1,5—2 атм. в течение 30 или 20 минут. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и снаружи пересыпают тальком для предохранения их от склеивания. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде помещают в биксы.
Стерилизация патогенных культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для дальнейшей работы, складывают в металлический бак, пломбируют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры патогенных микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 минут при давле¬нии 1 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производится специально выделенным лицом под расписку. Режим стерилизации регистрируется в специальном журнале. При уничтожении культур микробов I и II групп патогенности, а также материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями, отнесенными к этим группам, баки с отработанным материалом переносят на металлических подносах с высокими бортами в присутствии сопровождающего лица, допущенного к работе с заразным материалом.
Стерилизацию кипячением производят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. (Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы—в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне 30-60 минут. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.
Стерилизация сухим жаром.
Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150°С 2 ч, при 165°С – 1 ч, при 180°С – 40 мин, при 200°С – 10-15 мин (при 170°С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда тем¬пература в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование тре¬щин на горячей посуде.
Стерилизация паром под давлением.
Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутрен¬ний — стерилизационной камерой. В водопаровом котле происходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые прохо¬дит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава герметически привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомерное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для определения давления, создающегося в стерилизационной камере. Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл. 1).
Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды
Показания манометра, атм.
Показания манометра, атм.
Красная черта на шкале манометра определяет максимальное рабочее давление, которое допускается в автоклаве. Предохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерного повышения давления. Его устанавливают на заданное давление, то есть, давление, при котором нужно производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления.
На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две горизонтальные черты — нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой камере. Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилизации, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, нарушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала.
Правила работы с автоклавом.
Перед началом работы осматривают автоклав и контрольно-измерительную аппаратуру. В автоклавах с автоматическим регулированием пара на электровакуумном манометре водопаровой камеры стрелки устанавливают в соответствии с режимом стерилизации: нижнюю стрелку ставят на 0,1 атм. ниже, верхнюю—на 0,1 атм. выше рабочего давления, водопаровую камеру заполняют водой до верхней отметки мерного стекла. В период заполнения водой вентиль на трубе, по которой пар поступает в камеру, держат открытым для свободного выхода воздуха из котла. Стерилизационную камеру автоклава загружают стерилизуемым материалом. После этого крышку (или дверцу) автоклава закрывают, плотно закрепляя центральным затвором или болтами; чтобы избежать перекоса, болты завинчивают крест-накрест (по диаметру). Затем включают источник подогрева (электрический ток, пар), закрывая вентиль на трубе, соединяющей источник пара со стерилизационной камерой. С началом парообразования и создания давления в водопаровой камере производят продувку (удаление воздуха из стерилизационного котла). Способ удаления воздуха определяется конструкцией автоклава. Вначале воздух выходит отдельными порциями, затем появляется ровная непрерывная струя пара, указывающая, что из стерилизационной камеры воздух полностью вытеснен. После удаления воздуха кран закрывают, и в стерилизационной камере начинается постепенное повышение давления.
Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медленно ослабляют прижимные приспособления и открывают крышку автоклава.
Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен.
Контроль температуры в стерилизационной камере осуществляется периодически с помощью бактериологических тестов. Биотесты изготовляются бактериологическими лабораториями ЦСЭН. В случае непрохождения данных тестов производят проверку технического состояния автоклава.
Стерилизация текучим паром.
Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколь¬ко небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют, главным образом, питательные среды, свойства которых изменяются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеззараживания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 минут ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.
Тиндализация—дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемoгo материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60—65°С в течение 5 дней или при 70— 80°C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.
Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Бактериальные фильтры применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзотоксинов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как стерилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), способные задерживать бактерии.
Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3—5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: «Ф» (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерии, и «СФ» (стерилизующие), более плотные, задерживающие бактерии. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в автоклаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливаются из нитроцеллюлозы и представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.
Бактериальные фильтры различаются по величине пор и обозна¬чаются порядковыми номерами (табл. 2).
Методы стерилизации питательных сред и посуды, микробиология
Методы стерилизации питательных сред и посуды, микробиология / Methods of sterilization of nutrient media and dishes, microbiology
Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов. Различают термическую и холодную стерилизацию. Способы термической стерилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Методы холодной стерилизации: стерилизация фильтрованием, газообразными средствами, ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений.
Физико-химические свойства материала и стерилизация / Physical and chemical properties of the material and sterilization
Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяется в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.
Стерилизация питательных сред насыщенным паром под давлением (автоклавирование) Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспечивает особую эффективность данного способа (табл. 1).
Температура насыщенного пара при разных давлениях Давление Температура, нормальное, атм кПа °С 1,0 101,32 100 1,5 151,98 111 2,0 202,65 121 2,5 251,20 128 3,0 299,75 134 При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдержи6 вают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121 °С.
Стерилизацию текучим паром под давлением осуществляют в автоклавах. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление, в который помещают стерилизуемый материал на специальную подставку. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. По окончании времени стерилизации автоклав открывают, когда давление в нем сравняется с атмосферным. Преждевременное открывание крана автоклава недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. К работе с автоклавом допускаются только подготовленные лица! Подготовка сред к стерилизации.
Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками с бумажными колпачками. Стеклянные, резиновые, корковые и другие пробки завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111-138 °С, т.е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; а выше 138 0С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 атм. Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются, прежде всего, их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов.
Стерилизация легко разрушающиеся субстраты при 0,5 атм в течение 15-30 мин / Sterilization of easily degraded substrates at 0.5 atm for 15-30 minutes
Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,20 мкм. Наиболее широкое распространение в микробиологической практике получили мембранные фильтры, которые в зависимости от величины пор применяют для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют отечественные фильтры фирм «Владипор», «Владисарт» с диаметром пор 0,20 мкм. Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разными индексами.
Таблица 2 Время, необходимое для стерилизации стеклянной посуды сухим жаром Температура, °С Время, мин 140 180 150 150 160 120 170 60 Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. После этого еѐ загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный надежный прогрев стерилизуемого материала. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80 °С, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться. Стерилизация инструментов и приборов.
Стерилизация прокаливанием в пламени перед использованием, металлические инструменты / Flame sterilization before use, metal tools
Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 атм в течение 15-20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются.
Стерилизация газообразными веществами / Sterilization with gaseous substances
Лабораторную аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют газовым методом. Для газовой стерилизации применяются только те соединения, которые обладают спороцидными свойствами. Это оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах.
Стерилизуемые объекты, помещаемые в камеру, упаковывают как при стерилизации в автоклаве или сушильном шкафу. При проведении газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с ядовитыми газообразными веществами. Стерилизация облучением Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей, пищевых продуктов используют различные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, а-, Р- и у-лучи радиоактивных элементов. Чаще других в микробиологической практике используют ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см2
Любые исследования биологического материала проводятся в исчезающе малых количествах клеточного вещества. Для манипулирования с культурами, содержащими микроорганизмы, требуются специальные инструменты и приспособления. Микробиологическая петля входит в оснастку любой баклаборатории и выполняет функцию переноса жидкости и посева культуры в питательную среду проколом.
Принцип работы приспособления
В работе с биологическими средами имеет значение чистота опыта и безопасность исследователя. Задача, взять пробу или готовую культуру, размножить ее в питательной среде, исследовать под микроскопом.
Оператору необходимо приспособление для переноса культуры в жидком виде из одной среды в другую, учитывая особенности: титр первичного состава, количество микроорганизмов в единице объема. Для этого изобрели петли, удерживающие определенное количество жидкости за счет силы поверхностного натяжения. Вес перенесенного пленкой вещества измеряется в микронах.
Есть потребность вносить колонию микроорганизмов в твердую питательную среду проколом. Для этого требуется бактериологическая игла. Совмещение на одном стержне кольца с одной стороны и иглы с другой образует инструмент – микробиологическую или инокуляционную петлю. Инструмент должен иметь возможность стерилизации после каждой операции или быть одноразовым.
Устройство и материалы изготовления микробиологических петель
Для изготовления металлической петли с хвостиком подходит упругая витая проволока сечением 0,4-0,5 мм из нихрома, вольфрама или платины. Наиболее часто используют нихромовые кольца с хвостиком 7-9 см. Они стоят дешевле вольфрамовых, или платиновых. В ответственных опытах с высокой температурой стерилизации лучше воспользоваться вольфрамовыми приспособлениями. Из витой проволоки создают кольцо 1-5 мм в диаметре, хвостик закрепляют в алюминиевом стержне, на котором с другой стороны установлена микробиологическая игла – трехгранный штырь для прокола.
Устройство можно купить в сборе или отдельными элементами. Кольцо должно удерживать 1-10 мкл жидкости. Подбирают его, исходя из титра. Чем выше титр, тем меньший диаметр кольца из стандартного набора 1-5 мм. Металлическое приспособление откалибровано и сертифицировано, применяется для многократного использования со стерилизацией над открытом пламенем.
С развитием химии пластмасс появились микробиологические петли в виде стержней, на одной стороне которых кольцо нужного сечения, на другой игла. Изделия обрабатываются ионизаторами, поступают в стерильной упаковке и с сертификатом. Срок действия стерилизации 3 года. Приспособление можно использовать как одноразовое, стерилизовать спиртом или другими антисептиками. Материалом для изделий служит гибкий полистирол, полипропилена, АБС-пластик. Петля должна скользить по поверхности агара, не повреждая пленку.
Поставщиками продукции являются Италия, Индия, Китай. Появляются европейские производители.
Применение микробиологических петель
Изделия используют в научно-исследовательских лабораториях различного направления, но основное направление – посев и перепосев колоний живых культур. Исследования проводятся на клеточном уровне, часто под микроскопом.
Стерильное приспособление опускают кольцом в жидкую среду, отбирают порцию жидкости на предметное стекло или в чашку Петри. Этим же кольцом снимают пробу с жидкого агара, переносят в другое место – выполняя перевивку «зеркалом». Упругое колечко возьмет крупицу поверхности твердой питательной среды и размажет их по поверхности стекла с каплей воды.
Заостренный конец нужен, чтобы выполнить операции:
Выяснилось, стерилизация инструмента даже отжигом в открытом пламени после каждой операции не спасает от особо стойких штаммов бактерий. В таких случаях используют только одноразовые инструменты из пластика. Тогда головку с пробой отламывают и оставляют в жидкой среде.
Посев культуры на жидкую среду производят для преумножения колонии. На плотной среде вырастают отдельные колонии однородных организмов для изучения.
Резюме
В научной или производственной лаборатории биохимии использование микробиологических петель способствует чистоте опыта и корректности анализов. Купить сертифицированный материал выгодно можно в Уфе, в компании «Полихром».
Работаем со всеми регионами России, организуем доставку товара по согласованному маршруту.
