при какой температуре погибают бифидобактерии

При какой температуре погибают бифидобактерии

НИИЭМ им Гамалеи Н.Ф. РАМН г. Москва.
Руководитель группы условно-патогенных бактерий, Заслуженный деятель науки, д. м. н., профессор Мороз А. Ф.
13.10.2005

ПРОТОКОЛ проверки жизнеспособности бифидобактерий в препарате «Бифидум БАГ Жидкий концентрат бифидобактерий» («Вектор-БиАльгам») при различных температурных режимах и сроках хранения, их возможности противостоять обсеменению извне посторонними микроорганизмами и способности приживаться в организме человека.

1. Проверка сохранения титра и жизнеспособности бифидобактерий «Бифидум БАГ » при различных температурных режимах и сроках хранения.
1.1. Проверка сохранения титра биологически активных клеток бифидобактерий проводилась согласно общепринятой методике путем титрования в физиологическом растворе до 1012 с последующим посевом из разведений с 106 по 1012 и микроскопией.
Вскрытые флаконы хранились в холодильнике при t +40 С.
Контроль титра осуществлялся ежедневно в течение полутора (1,5) месяцев.

НИИЭМ им Гамалеи Н.Ф. РАМН г. Москва.
Руководитель группы условно-патогенных бактерий, Заслуженный деятель науки, д. м. н., профессор Мороз А. Ф.
13.10.2005

ПРОТОКОЛ проверки жизнеспособности бифидобактерий в препарате «Бифидум БАГ Жидкий концентрат бифидобактерий» («Вектор-БиАльгам») при различных температурных режимах и сроках хранения, их возможности противостоять обсеменению извне посторонними микроорганизмами и способности приживаться в организме человека.

1. Проверка сохранения титра и жизнеспособности бифидобактерий «Бифидум БАГ » при различных температурных режимах и сроках хранения.
1.1. Проверка сохранения титра биологически активных клеток бифидобактерий проводилась согласно общепринятой методике путем титрования в физиологическом растворе до 1012 с последующим посевом из разведений с 106 по 1012 и микроскопией.
Вскрытые флаконы хранились в холодильнике при t +40 С.
Контроль титра осуществлялся ежедневно в течение полутора (1,5) месяцев.

1.2. Проверку жизнеспособности бифидобактерий в не вскрытых флаконах «Бифидум БАГ» проводили при следующих условиях:
• при комнатной температуре (t +210 С) в течение 10суток
• в термостате при t +370С в течение 48 часов с последующим посевом и микроскопией.
2. Проверка способности противостоять обсеменению извне посторонними микроорганизмами в открытых флаконах при различных температурных режимах хранения.
В течение 10 суток ежедневно проводилась проверка на присутствие посторонней флоры вскрытых флаконов, хранившихся при температурах t +40С, t +210С, t +370С с последующим посевом и микроскопией.
3. Проверка способности приживаться в организме человека.
Приживаемость бифидобактерий препарата «Бифидум 791БАГ» в организме человека определялась клиническими и лабораторными данными, полученными от более 1000 обследованных и пролеченных по поводу дисбактериоза кишечника.

Источник

Лиофилизация остается наиболее эффективным способом консервирования микроорганизмов

ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ КОНСЕРВИРОВАНИЯ

Сохранение штаммов культур в жизнеспособном состоянии без потери производственно-ценных свойств является одной из важных задач в пищевой биотехнологии. Анабиоз как естественный процесс выживания клетки остается наиболее эффективным способом консервирования бактерий. Длительность хранения бактерий, введенных в ксероанабиоз, достигает 50 лет с сохранением высокой плотности популяций в препарате.

В связи с огромным разнообразием существующих микроорганизмов единого протокола сохранения микробных культур, отвечающего всем предъявляемым требованиям, не существует. Методы хранения микробных культур широко варьируют для разных видов микроорганизмов в силу большого разнообразия присущих им биологических свойств. Даже для разных штаммов одного вида не всегда приемлем один и тот же метод [3].

Изучение способности пробиотических микроорганизмов переживать стрессовые условия при замораживании и сублимации вызвано научным интересом в рамках теории адаптации и необходимостью создания продуктов на основе устойчивых пробиотических культур, длительное время сохраняющих способность к размножению, без утраты и изменения нативных свойств.

Объекты и методы исследований

Объектом исследований являлась ассоциация культур бактерий Propionibacterium shermanii, Bifidobacterium bifidum и Lactococcus lactis из фонда ВКПМ (г. Москва).

Наращивание биомассы консорциума пробиотических микроорганизмов проводили на сывороточной среде с добавлением буферных солей, структурирующего агента и антиоксидантов с промежуточной нейтрализацией до наступления стационарной фазы. Для оптимизации среды в целях повышения синтезэкзополисахаридов микроорганизмами закваски использовали стерильный 1%-ный раствор селенита натрия.

Лиофилизацию биомассы бактерий проводили на аппарате сублимационной сушки марки VacuPro II. Для количественного учета микроорганизмов использовались стандартные бактериологические методы.

Результаты и их обсуждение

Длительное хранение бактерий с сохранением ценных свойств основано на ингибировании протекающих обменных процессов в клетке. К таким способам относятся криоанабиоз микроорганизмов и высушивание бактерий из замороженного состояния (лиофилизация). Эффект консервации при сублимации достигается путем снижения активности воды путем удаления свободной влаги в условиях субнулевых температур.

При замораживании для защиты биомассы применяли среду на основе сахарозы и натрия лимоннокислого. В присутствии в среде натрия лимоннокислого происходят обратимые повреждения аминокислотной транспортной системы клетки, сахароза повышает вязкость среды, снижая скорость движения молекул воды и обезвоживания мембран.

Концентрированную биомассу смешивали с защитной средой в равных соотношениях и замораживали при температуре минус (18-22) о С. После реактивации замороженного препарата определяли количество жизнеспособных клеток. Влияние процесса замораживания на сохранность жизнеспособных клеток показано на рисунке 1.

Рисунок 1 – Выживаемость культур консорциума при замораживании

Как видно из представленных данных, количество жизнеспособных клеток снижается незначительно, культуры консорциума обладают устойчивостью к повреждающим факторам криоконсервации. Экзополисахариды (ЭПС), вырабатываемые бактериями, обладают гидрофильными свойствами, что способствует дополнительному повышению вязкости среды. ЭПС в бактериальной клетке выполняют защитную функцию, предотвращая высыхание. Замораживание и высушивание высокопродуктивных ЭПС-синтезирующих культур возможны без дополнительных протекторов, однако устойчивость таких препаратов при длительном хранении и реактивации требует дальнейшего изучения.

Чувствительность разных видов микробов к замораживанию-оттаиванию неодинакова. В литературе имеются сведения, что грамотрицательные бактерии более чувствительны к замораживанию, чем грамположительные. Из грамположительных микробов наибольшей устойчивостью обладают кокки. Подобное различие, вероятно, связано с особенностями строения клеточной стенки. Даже в пределах одного вида разные штаммы показывают неодинаковую чувствительность к низким температурам [3].

К достоинствам криогенного хранения относят малое количество технологических операций и контрольных критических точек, повышающих вероятность вторичного обсеменения культур, обеспечение постоянства свойств микроорганизмов и доступность компонентов для подготовки протективной среды.

К недостаткам данного способа относят относительно короткую продолжительность хранения. Максимальный рекомендованный срок составляет 12 мес.

На следующем этапе была изучена жизнеспособность пробиотических культур консорциума в условиях сублимационного высушивания.

Лиофилизацию проводили после концентрирования биомассы бактерий путем центрифугирования в течение 20 мин при частоте n=3000 об./мин. Далее биомассу в асептических условиях смешивали с защитной средой в соотношении 1:1 и замораживали при температуре минус 20 о С.

После полного замораживания биомассу высушивали при следующих условиях: p=(0,01-0,03) атм., Т= минус (50,3-51,2) о С, τ=28 ч. Количественные показатели по выходу концентрированной биомассы рассмотрены в таблице 1.

Таблица 1. Выход биомассы консорциума пробиотических бактерий

Источник

Температурный режим для пробиотиков PROPIONIX

УСТОЙЧИВОСТЬ ТИТРА И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК БИФИДО- И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ТРАНСПОРТИРОВКЕ БЕЗ ТЕРМОРЕЖИМА

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ

Начиная с 2013 года, микробиологическая продукция ООО «Пропионикс» транспортируется по всей территории РФ вне температурного режима, установленного для хранения. Из всей термоизоляции используется только материал картонных коробок (штатной упаковки и транспортной упаковки-тары) с естественными воздушными прослойками. Почему принято такое решение? А принято оно для того, того, чтобы клиент не переплачивал, за несуществующую угрозу сохранности свойств биоконцентратов при транспортировке…

ТРАНСПОРТИРОВКА ПРОБИОТИКОВ БЕЗ ТЕРМОРЕЖИМА

Немного теории.

Суть в том, что наши бактерии-пробиотики находятся во флаконе в жидкой консервирующей среде (осветленной творожной сыворотке) в стационарной фазе с оптимальным кол-вом питательных веществ для поддержания их жизнеспособности. При хранении в холодильнике пробиотические микроорганизмы находятся в своеобразном «анабиозе», при котором метаболизм внутри клеток замедлен, поэтому питательные вещества для роста и развития клеток бактерий практически не расходуются. Если идет повышение температуры (на10, 20 или 30 о С), повышается и активность бактерий, а соответственно они начинают нуждаться в факторах роста (мы не рассматриваем температуру от +40 о С и выше, т.к. речь уже будет идти о тепловом стрессе (шоке), и дальнейшей гибели клеток посредством разрушения их белковых структур).

В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде (для этого служит лактоза сыворотки) и водороде для построения собственных белков. Водород для клеток поставляет вода. Как правило, источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения, а также белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Осветленная творожная сыворотка в этом плане – идеальная среда для нормального роста бактерий. В ней есть необходимые витамины, следы сывороточных белков (пептиды), немного лактозы и т.д.

Объем питательных веществ ограничен, и при дальнейшем нахождении микроорганизмов в тепле часть бактерий начинает переходить в фазу отмирания, их клетки разрушаются. Происходит т.н. автолиз – саморастворение живых клеток под действием их собственных гидролитических ферментов, разрушающих структурные молекулы. Общей причиной автолиза для микроорганизмов любого таксона является исчерпание источников питания и энергии.

Индукция автолиза происходит при:

Защитные факторы.

Однако снижение показателя КОЕ/см 3 при хранении биоконцентратов вне холодильника происходит не сразу и не быстро, т.к. эволюционно клетки бактерий (бифидо- и пропионовокислых) имеют адаптационные механизмы защиты от голода (исчерпания источников питания и энергии), а также от других стрессовых факторов, таких как изменение температуры, низкие значения рН, замораживание и обезвоживание.

Рассмотрим для примера защитные свойства молочных (классических) пропионовокислых бактерий (ПКБ) вида P. Freudenreichii. Что касается ПКБ, то защитными факторами у них выступают такие метаболиты, как полифосфаты, гликоген, трегалоза, экзополисахариды, а также способность к синтезу реактивирующих белков теплового шока (шаперонов).

Реактивирующие факторы

Экзополисахариды

Эксперименты, исследования

Таким образом, при условии средней продолжительности транспортировки продукции по территории всей России транспортными компаниями всего от 1 до 4 суток (и даже в случае непредвиденной задержки в пути), свойства продукции гарантированно останутся в пределах допустимой нормы. Также, данный вывод дополнительно подтверждается экспериментом от производителей аналогичной (пробиотической) продукции (см. ниже):

Как следует из протокола ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН от 13.10 2005 г., по результатам эксперимента (хранение Бифидум №791БАГ при комнатной температуре (t +21 0 С) в течении 10 суток) начальный титр 10 12 жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов данного препарата сохранялся все 10 суток проверки. То есть даже не изменился!

Вывод: Транспортировка жидких пробиотиков по России допустима вне температурного режима (установленного для длительного хранения) в штатной упаковке и в стандартные сроки, установленные транспортными компаниями (в т.ч. почтой).

Источник

При какой температуре погибают бифидобактерии

Технология сохранения жидких концентратов бифидобактерий и лактобацилл на основе стабилизированной активированной низкоминерализованной воды в метастабильном состоянии

Получение вышеуказанных результатов стало возможным благодаря использованию в процессе культивирования жидких концентратов бифидобактерий и лактобацилл низкоминерализованного стабилизированного активированного водного раствора в метастабильном состоянии с отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом (патент РФ No 2234945).

Указанная технология позволяет производителю жидких пробиотиков значительно сократить расходы на производство и хранение готовой продукции, расширить рынок её сбыта.

Ключевые слова: окислительно-восстановительный потенциал (ОВП), метастабильное состояние, стабилизация ОВП, стабилизация редокс – потенциала, жидкие пробиотики, бифидобактерии, лактобациллы, культивирование бифидобактерий, увеличение срока хранения жидкой формы пробиотиков

Статья имеет информационный характер и предназначена в первую очередь для потенциальных Лицензиатов и Инвесторов.

Общепризнанна роль, которую играют в поддержании здоровья человека бифидобактерии. Этот вопрос освещен во многих литературных источниках (см., например, [1, 2]). Поэтому перечислим лишь вкратце те положительные воздействия, которые оказывают бифидобактерии (пробиотики) на организм «хозяина». Итак, жизнедеятельность бифидобактерии:

— тормозит рост раковых клеток кишечника;

— подавляет активность гнилостных и патогенных бактерий;

— стимулирует продуцирование витаминов;

— активизирует иммунные процессы;

— обеспечивает защиту от кишечной инфекции;

— активизирует кишечные функции.

— участвует в усвоении питательных веществ, витаминов и микроэлементов.

Важно отметить, что эти положительные воздействия на организм являются результатом метаболической деятельности бифидофлоры толстого кишечника, точнее, действием конечных продуктов метаболизма — конститутивных и индуцирующих ферментов: гликозидазы, уреазы, декарбоксилазы, азоредуктазы, нитроредуктазы и др. Фактически кишечная микрофлора имеет более высокую ферментативную активность, чем печень, и поэтому она иногда рассматривается как своего рода анаэробный орган «хозяина», его «вторая печень». С течением жизни микробный пул кишечника меняется и, как правило, не в пользу бифидобактерии, количество которых под воздействием ряда негативных факторов (антибиотики, экология, стрессы и пр.) постоянно сокращается и можно сказать, что в отсутствии специальных корректирующих мероприятий «вторая печень» со старением организма постепенно умирает. Важно отметить отсутствие фатальной зависимости состояния бифидофлоры от физического возраста организма. Более того, в многочисленных исследованиях показана зависимость такой функциональной системы, какой является микробный пул кишечника, от внешних воздействий, как положительных, так и отрицательных.

Сегодня при лечении и профилактике самых разных заболеваний все более широко используются пробиотики — бактерийные сухие или жидкие препараты из живых микробных культур (бифидобактерий и лактобактерий), предназначенные для коррекции микрофлоры хозяина (т. е. человека или даже животных, для которых выпускаются свои препараты) и лечения ряда заболеваний.

Бурное развитие исследований по разработке новых биопрепаратов и изучению механизма их лечебно-профилактического действия дает основания утверждать, что в XXI веке пробиотики в значительной степени потеснят на рынке традиционные и небезопасные для организма препараты, особенно те из них, которые применяются с профилактической целью.

Достоинством сухих препаратах («Бифиформ», «Линекс», «Бактисубтил» и др.) следует считать то, что бактерии находятся как бы в состоянии спячки. Поэтому они не так чувствительны к перепадам температурного режима, их проще хранить. Такие препараты можно брать с собой в поездку и не бояться, что они испортятся в дороге. Однако, в случае использования сухих бифидобактерийных препаратов или сухих бифидозаквасок прямого внесения, не всегда можно говорить о получении эффективного бифидопродукта питания, так как большинство штаммов бифидобактерии при сушке значительно изменяют свою активность, находясь в глубоком анабиозе и восстанавливают её только лишь после 3—5 делений после попадания в благоприятную для размножения среду. Часто такие бифидобактерии просто не успевают это сделать, попав, будучи сухими, в кишечник, и благополучно выносятся из него с фекалиями, не успев сделать свою полезную работу. Им требуется порядка 8—10 часов для перехода к активному физиологическому состоянию, однако к этому времени большая их часть уже может быть естественным образом элиминирована из кишечника. Для того, чтобы хоть какая-то часть бактерий закрепилась в кишечнике, их концентрация в сухих препаратах должна быть не менее чем 10 12-14 живых бактерий в 1 грамме сухого порошка. Столь высокую концентрацию живых бактерий получить в условиях распылительной сушки или лиофилизации практически невозможно, т. к. от 10 — 25 % популяций бактерий –пробиотиков гибнет, а сохранившие жизнеспособность бактерии резко снижают свою пролиферативную активность, в результате чего основная доля бактерий – пробиотиков при их назначении проходит через кишечник человека и животных транзитом, оказывая лишь минимальное лечебно-профилактическое действие и не проявляя способности к колонизации (заселению) данной экологической ниши. При более низкой концентрации живых бифидобактерий в сухом препарате эффекта от его применения практически не будет. Поэтому их эффективность выше у людей, страдающих запорами, — у бактерий оказывается достаточно времени на обретение активности. И напротив, если речь идет о ребенке, особенно младшего возраста, или о животном (котёнок, щенок, телёнок, поросёнок) у которых скорость продвижения пищи по кишечнику в несколько раз выше, чем у взрослого человека или животного, или же о взрослом человеке или животном со склонностью к диарее, эффект может быть ниже именно из-за нехватки времени для «пробуждения» бактерий.

Недостатком также следует считать высокую себестоимость производства сухих концентратов вследствие того, что оборудование для сушки (лиофилизации), располагающееся в технологической цепочке производства концентрата, настолько дорогостоящее, что далеко не каждое предприятие может позволить себе его закупить.

В отличие от сухих, в жидких пробиотиках бактерии постоянно находятся в активном состоянии. Главное достоинство жидких пробиотиков заключается в том, что бактерии в них находятся в живой биологически активной форме. Свое благотворное воздействие они оказывают незамедлительно — сразу после приема препарата, что выгодно отличает жидкие пробиотики от аналогичных сухих препаратов. Кроме живых бактерий жидкие пробиотики содержат продукты жизнедеятельности этих весьма полезных для организма человека биологически активных веществ: незаменимые аминокислоты, органические кислоты, витамины, интерфероностимулирующие и иммуномодулирующие вещества.

Жидкие пробиотики благодаря своим поистине уникальным лечебным, профилактическим, общеукрепляющим действиям охватывают практически все области медицины. Длительная апробация в ведущих клиниках во многих регионах России показала высокую эффективность их применения в гастроэнтерологии, проктологии, акушерстве и гинекологии, педиатрии, хирургии и травматологии, фтизиатрии, дерматовенерологии, онкологии, в спортивной медицине, косметологии, в гидроколонотерапии и других областях.

Можно также утверждать, что более надежным при изготовлении биопродуктов (бифидопродуктов) является использование в технологиях их изготовления жидких концентратов (заквасок) бифидобактерий, которые содержат действительно живые бифидобактерии. Одним из главных условий эффективности жидких концентратов бифидобактерий должна быть очень высокая концентрация живых бифидобактерий при выпуске — не менее 10 10 бифидобактерий в 1 мл., и не менее 10 9 бифидобактерий в конце 2-3-х месячного срока хранения концентрата, а также обязательное использование гидролизата молочного белка в концентрате и гидролизата дрожжей. Такие бифидоконцентраты именуются: «Активный жидкий концентрат бифидобактерий «- (ЖКБ) и «Активная жидкая закваска бифидобактерий » (для производителей бифидокефира и других кисломолочных продуктов). Из таких бифидоконцентратов получаются по настоящему эффективные бифидосодержащие кисломолочные продукты, а при непосредственном их применении в виде БАДа также получаются эффективные результаты при лечении дисбактериозов.

Жидкие пробиотики одинаково полезны и безопасны и для взрослых, и для детей. Жидкие пробиотики намного дешевле сухих препаратов (по количеству содержащихся в них живых бактерий), что объясняется отлаженными технологиями культивирования и отсутствием стадии сушки. Жидкие пробиотики помогут победить уже возникший недуг, избежать излишнего применения антибиотиков, часто наносящих непоправимый вред организму, облегчат состояние при хронических заболеваниях. Неоценимую помощь они окажут и в деле профилактики многих тяжелых заболеваний, лечение которых может оказаться более дорогостоящим и длительным. Комплексное использование жидких пробиотиков дает возможность более результативно стабилизировать микрофлору кишечника, обмен веществ и укрепить иммунитет.

В настоящее время на рынке БАД известны следующие жидкие пробиотики:

При этом срок 1,5 — 3 месяца при температуре + 4-6 о С соответствует идеальным условиям хранения и не удовлетворяет интересам производителя и потребителя.

Между тем, хорошо известно, что бифидобактерии имеют ряд отличительных особенностей в энергетическом обмене, потребностях в ростовых факторах. Являясь анаэробами, они способны начать рост только в отсутствии кислорода и при достаточно низком окислительно —восстановительном потенциале среды (Eh). В тонком отделе кишечника из-за низкого рН и достаточно высокого уровня кислорода возможен лишь скудный рост микроорганизмов. Уже в процессе формирования защитных биоплёнок происходит более стабильное расселение нормофлоры по специфическим для них локусам. Бифидобактерии как наиболее строгие анаэробы колонизируют наиболее близкую к эпителию зону, где всегда поддерживается отрицательный окислительно-восстановительный потенциал (причём не только в толстой кишке, но и в других, более аэробных биотопах организма: в ротоглотке, влагалище, на кожных покровах). Лактобациллы, среди которых помимо облигатных анаэробов часто встречаются микроаэрофилы, колонизируют второй слой приэпителиальной зоны. При этом следует отметить, что очень часто и совершенно необоснованно лактобациллы относят к аэробному компоненту нормобиоценоза и рассматривают эту крайне важную для хозяина микрофлору как факультативную (сопутствующую). Большинство бактерий рода Lactobacillus являются облигатными анаэробами или микроаэрофилами и они могут противостоять лишь небольшим концентрациям кислорода (3).

В результате проведенных промышленных исследований было обнаружено, что питательная среда культивирования бифидобактерий и лактобацилл, основу которой составляет низкоминерализованная стабилизированная активированная вода в метастабильном состоянии с отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом, позволяет:

— увеличить выход объёма биомассы бифидобактерий и лактобацилл более чем на 250 %;

— вдвое сократить время культивирования;

— увеличить срок хранения жидкой формы готовой продукции как при температуре +4-6 о С, так и при температуре + 30 о С не менее чем до 6 (шести) месяцев.

— значительно увеличить резистентность бифидобактерий и лактобацилл по отношению к кислотному барьеру желудочно-кишечного тракта.

Выводы: хранение жидких концентратов пробиотиков в течение не менее 6 (шести) месяцев в интервале температур от + 4-6 о С до + 30 о С сопоставимо со временем и температурным режимом хранения сухих пробиотиков, что позволяет производителю значительно сократить расходы на хранение готовой продукции, расширить рынок её сбыта. Двойное сокращение сроков культивирования при одновременном увеличении объёма выхода биомассы в 2,5 раза позволяет производителю значительно сократить расходы на производство готовой продукции.

1. Chou К. М. Selection of bifidobacteria for use as dietary adjuncts in cultured dairy foods. M. S. Thesis, Jhe Onto state University, Onio (1995).

2. Lankaputhra W. E. V. & Shah H. P. Survival of Lactobacillus acedophilus and Bifidobacterium spp. in the presence of acid and bilesalts Cult. Dairy Prodi. 30 (3): 2(1995).

3. Квасников Е. И., Нестеренко О. А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975. 389 с.

Источник